Amlodipina w terapii nowotworów – nowe zastosowanie znanego leku

Jak amlodipina wpływa na nowotwory?

Amlodipina hamuje uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych nowotworowych i spowalnia wzrost guza – nowy kierunek terapii przeciwnowotworowej

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEVs) produkowane przez komórki nowotworowe, określane jako egzosomy pochodzenia nowotworowego (TEX), odgrywają kluczową rolę w regulacji wzrostu guza oraz modulacji funkcji układu odpornościowego gospodarza. TEX stanowią system komunikacji między komórkami nowotworowymi a komórkami prawidłowymi, wspierając wzrost nowotworu oraz indukując dysfunkcję lub śmierć komórek efektorowych układu immunologicznego zarówno in vitro, jak i in vivo. Obecność i liczba TEX w osoczu pacjentów z chorobą nowotworową koreluje z punktami końcowymi kliniczno-patologicznymi oraz aktywnością choroby. Nowotwory produkują i uwalniają biologicznie aktywne TEX w liczbach znacznie przekraczających te obserwowane w osoczu zdrowych osób. Dlatego usunięcie TEX z osocza lub wyciszenie negatywnego (immunosupresyjnego) sygnalizowania przez TEX mogłoby stanowić potencjalnie skuteczną strategię terapeutyczną w walce z nowotworami.

Najnowsze badania wskazują, że amlodipina (AMD), bloker kanałów wapniowych powszechnie stosowany w leczeniu nadciśnienia tętniczego, może hamować uwalnianie sEV z komórek nowotworowych. Naukowcy z Uniwersytetu w Pittsburghu przeprowadzili serię eksperymentów mających na celu weryfikację hipotezy, że AMD blokuje uwalnianie TEX przez ludzkie komórki nowotworowe in vitro i mysie komórki nowotworowe in vivo, hamując tym samym wzrost guza i promując przywrócenie odporności przeciwnowotworowej. Wyniki badań są obiecujące i wskazują na potencjał amlodipiny jako leku przeciwnowotworowego.

Czy AMD hamuje uwalnianie TEX in vitro?

W badaniach in vitro z wykorzystaniem mysich komórek SCCVII oraz ludzkich linii komórkowych nowotworów głowy i szyi (HNSCC) – PCI-13 i SCC47, naukowcy wykazali, że leczenie komórek nowotworowych wzrastającymi stężeniami AMD (0,5-5,0 μM) przez 48 godzin nie wpływało na żywotność komórek, ale znacząco zmniejszało uwalnianie TEX do supernatantu. Co istotne, po usunięciu AMD i zastąpieniu go świeżym medium, liczba TEX uwalnianych przez komórki nowotworowe powracała do wartości obserwowanych w kontrolach nieleczonych w ciągu 48 godzin. Sugeruje to, że ciągła obecność AMD jest niezbędna do zahamowania uwalniania TEX przez komórki nowotworowe.

AMD nie tylko zmniejszał liczbę TEX uwalnianych przez komórki nowotworowe, ale również znacząco zmniejszał proliferację komórek nowotworowych i selektywnie zmieniał zawartość białek w TEX. Efekty AMD na proliferację komórek nowotworowych były zależne od stężenia i czasu, stając się znaczące dopiero po 72-godzinnej hodowli. Ponadto, AMD zmieniał zawartość komórkową białek PD-L1 i Rab11 w komórkach nowotworowych, sugerując, że ekspresja białek związanych z regulacją immunologiczną (PD-L1) i wydzielaniem TEX (Rab11) została zaburzona. Obrazowanie komórek SCCVII traktowanych AMD wykazało akumulację licznych dużych agregatów pęcherzyków znakowanych Rab7 w cytoplazmie, co sugeruje, że AMD wpływa na proces pęcherzykowania, prawdopodobnie poprzez zapobieganie uwalnianiu pęcherzyków i zwiększenie ich akumulacji w cytoplazmie.

Analizy Western blot wykazały, że AMD zmniejszał ekspresję Rab11, Rab-27, PD-L1 i TGF-β1, ale nie wpływał na poziomy EGFR czy CD40L. Jednocześnie poziomy ekspresji ALIX, TSG101, PD-1 i FasL wzrastały w komórkach SCCVII traktowanych AMD. TEX produkowane przez komórki SCCVII traktowane AMD wykazywały wzbogacenie w ALIX, TSG101 i FasL oraz minimalną ekspresję PD-L1. Obserwowano brak Rab11 i Rab27a w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych zarówno z komórek traktowanych PBS, jak i AMD.

Które wyniki in vivo potwierdzają potencjał AMD?

Badania in vivo przeprowadzono na kilku kohortach myszy C3H-HeJ. W początkowych eksperymentach, zdrowym myszom podawano dootrzewnowo PBS lub AMD w dawce 10 mg/kg dziennie przez 15 dni, mierząc liczbę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w osoczu. Chociaż obserwowano zmniejszenie liczby EV, zmiany nie były statystycznie istotne ze względu na dużą zmienność między poszczególnymi myszami. Przy wyższej dawce AMD (15 mg/kg) myszy wykazywały pobudzenie i agresję, co sugerowało, że ta dawka może wpływać na dobrostan zwierząt.

W modelu przerzutów do płuc, komórki SCCVII (1 × 10⁵) wstrzykiwano dożylnie myszom C3H-HeJ, a codzienne iniekcje AMD rozpoczynano 4 dni po podaniu komórek nowotworowych. Liczba przerzutów do płuc była mniejsza u myszy leczonych AMD, choć precyzyjne określenie liczby było utrudnione ze względu na tendencję licznych guzków przerzutowych do zlewania się.

W modelu podskórnym SCCVII, 2 × 10⁶ komórek SCCVII wstrzykiwano podskórnie w prawy bok myszy C3H-HeJ. Codzienne podawanie dootrzewnowe AMD w dawce 10 mg/kg hamowało wzrost guza. Objętości guzów w momencie poświęcenia zwierząt (dzień 27) były znacząco zmniejszone. Masy guzów również były znacząco mniejsze u myszy leczonych AMD w porównaniu z kontrolami. Waga i rozmiary wyciętych guzów były również znacząco mniejsze u myszy leczonych AMD. Całkowita liczba sEV w osoczu nie była zmniejszona u myszy leczonych AMD, jednak badanie EVs wydzielanych z wyciętych tkanek guza wykazało, że liczba sEV/gram tkanki guza miała tendencję do zmniejszania się. Dane te sugerują, że AMD selektywnie wpływa na poziom produkcji/uwalniania EVs pochodzenia nowotworowego, tj. TEX, i ma bardzo zróżnicowany wpływ na całkowitą liczbę sEV w osoczu.

Badanie EVs wydzielanych z guzów myszy leczonych AMD wykazało niższe poziomy PD-L1 i Rab11, podczas gdy poziomy CD63, EGFR lub Fas nie różniły się od kontroli PBS. Histopatologia guzów od myszy leczonych AMD wykazała znacznie zaburzoną morfologię komórkową. Barwienie immunohistochemiczne tkanek guza przeciwciałami anty-Ki67 wskazywało, że guzy od myszy leczonych AMD miały mniej komórek Ki67+ niż kontrole. Co ważne, infiltracja komórek CD8+ T do tkanki guza była znacząco zwiększona u myszy leczonych AMD w porównaniu z nieleczonymi kontrolami.

Aby ocenić potencjalny wpływ płci na odpowiedź guzów SCVII na AMD, eksperymenty przeprowadzono zarówno na samicach, jak i samcach myszy. Wyniki wskazywały na podobne efekty AMD na wzrost guza i liczbę sEV w osoczu, niezależnie od płci zwierząt.

Jakie perspektywy terapeutyczne niesie zastosowanie AMD?

Dane wskazują na to, że AMD indukuje autofagię w komórkach nowotworowych, o czym świadczy zwiększona ekspresja białek ATG7, Beclin-1 i LC3 w komórkach SCCVII traktowanych AMD. Te wstępne wyniki sugerują, że AMD promuje autofagię w komórkach nowotworowych, która jest indukowana przez sygnały autokrynne napędzane przez TEX i nie obejmuje zewnątrzpochodnej apoptozy komórek nowotworowych.

Dostępne dane potwierdzają główną rolę wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ w regulowanej egzocytozie w większości typów komórek, w tym komórek nowotworowych. Wykazano, że akumulacja wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ w ciałkach wielopęcherzykowych (MVB) stymuluje wydzielanie sEV. Mechanistycznie, błona pęcherzyka wydzielniczego (MVB) łączy się z błoną komórkową w ściśle kontrolowanej reakcji wyzwalanej przez Ca²⁺, która reguluje uwalnianie pęcherzyków. Ostre podwyższenie poziomu Ca²⁺ w komórkach nowotworowych jest uniwersalnym wewnątrzkomórkowym sygnałem dla regulowanego pęcherzykowania/wydzielania. Podwyższenie poziomu Ca²⁺ w komórkach nowotworowych stymulowało 5-krotny wzrost uwalniania egzosomów CD63⁺CD9⁺ALIX⁺. To odkrycie dostarcza wiarygodnego wyjaśnienia, dlaczego komórki nowotworowe produkują i uwalniają podwyższoną liczbę pęcherzyków w porównaniu do komórek nienowotworowych i dlaczego osocze pacjentów z chorobą nowotworową zawiera podwyższoną liczbę EV.

Podsumowując, AMD, kanoniczny inhibitor kanałów wapniowych, szeroko stosowany w leczeniu obniżającym ciśnienie krwi, hamuje wzrost mysich i ludzkich nowotworów w hodowli oraz mysich SCCVII in vivo. Te hamujące wzrost efekty były związane ze zmniejszeniem liczby TEX uwalnianych przez komórki SCCVII, zmianami w białkach immunoregulacyjnych przenoszonych przez TEX oraz zwiększoną infiltracją guza przez komórki T CD8+. Zaobserwowano zmiany w architekturze komórkowej guza i zdolności komórek nowotworowych do migracji, o czym świadczy utrata morfologii fibroblastopodobnej. Poprzez zakłócenie produkcji/uwalniania TEX z komórek nowotworowych, AMD ingerował w autokrynne szlaki nowotworowo-TEX, w tym autofagię, które są niezbędne do przeżycia nowotworu. Jednocześnie zwiększała się liczba naciekających guz komórek efektorowych układu odpornościowego, prawdopodobnie przyczyniając się do zahamowania wzrostu guza.

Selektywne zahamowanie immunosupresyjnej produkcji/uwalniania TEX przez AMD jawi się jako potencjalnie skuteczna strategia terapeutyczna przywracająca odporność u pacjentów z nowotworami. Biorąc pod uwagę, że wielu pacjentów z chorobą nowotworową przyjmuje inhibitory kanałów wapniowych w celu kontroli ciśnienia krwi, przekwalifikowanie AMD jako terapii przeciwnowotworowej u tych pacjentów byłoby bezproblemowe z regulacyjnego punktu widzenia. Jednakże możliwe jest, że inne blokery kanałów wapniowych powszechnie stosowane w kontroli nadciśnienia, np. nifedypina lub felodypina, mogą również blokować kanały wapniowe w komórkach nowotworowych, co może wpływać na skuteczność terapii AMD. Dalsze badania in vivo na mysich modelach nowotworów są wskazane w celu dalszego wyjaśnienia potencjalnej interferencji innych blokerów kanałów wapniowych z terapią AMD.

Podsumowanie

Badania przeprowadzone przez naukowców z Uniwersytetu w Pittsburghu wykazały, że amlodipina (AMD) – powszechnie stosowany lek na nadciśnienie – hamuje uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (TEX) z komórek nowotworowych. W badaniach in vitro na liniach komórkowych nowotworów głowy i szyi wykazano, że AMD zmniejsza uwalnianie TEX, spowalnia proliferację komórek nowotworowych oraz modyfikuje zawartość białek w pęcherzykach. Eksperymenty in vivo na modelach mysich potwierdziły skuteczność AMD w hamowaniu wzrostu guza i zmniejszaniu liczby przerzutów. Lek zwiększał infiltrację komórek odpornościowych CD8+ w tkance guza i zaburzał morfologię komórek nowotworowych. Mechanizm działania AMD związany jest z regulacją poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego i indukcją autofagii. Te odkrycia sugerują możliwość przekwalifikowania amlodipiny jako leku przeciwnowotworowego, szczególnie u pacjentów już przyjmujących ten lek w terapii nadciśnienia.